微生物菌种资源冷冻干燥和低温冷冻保藏技术规程

1 范围

微生物菌种资源冷冻干燥和低温冷冻保藏技术规程

本规程介绍了微生物菌种冷冻干燥和低温冷冻保藏技术的定义、原理、技术、要求、方法与步骤。

本规程适用于普通细菌、放线菌、酵母菌、部分丝状真菌及担子菌、病毒等

微生物菌种的保藏。

对于病原微生物及其他需要特殊操作技术的微生物菌种保藏参见相应的技术

规程。

2 规范性引用文件

下列文件中的条款通过本规程的引用而成为本规程的条款。凡是注日期的引

用文件，其随后所有的修改单〈不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本规

程，然而，鼓励根据本规范达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版

本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本规程。

GB 19489 实验室生物安全通用要求

国务院令第424 号《病原微生物实验室生物安全管理条例》

3 术语和定义

下列术语和定义适用于本规程:

3.1 冷冻干燥freeze - drying

冷冻干燥法的原理是微生物细胞在冷冻、减压条件下，发生"升华"脱水，

细胞的生理活动趋于停止，得以长期维持存活状态。

3.2 液氮超低温保藏preservation in liquid nitrogen

液氮超低温保藏技术是将微生物菌种保藏在一196.C 的液态氮中，或保藏在

- 150 .C 的气相氮中。其原理是微生物的在一130.C 以下新陈代谢趋于停止，因而

能长期、有效地保藏。

3.3 -80"C低温保藏preservation at -80"C

将微生物菌种保藏在一80 0C 冰箱的一种保藏方法。原理是低温条件可减缓微

生物的新陈代谢，以达到长期有效地保藏微生物。

4 微生物菌种的冷冻干燥保藏技术规程

4.1 冷冻干燥保藏工作流程

参见附录A <<冷冻干燥保藏工作流程》。

4.2 冷冻干燥管的选择与清洗

冷冻干燥管一般采用耐温度骤变，耐压，管壁厚度均一并且为中性玻璃的安

瓶管。管的内径为8mm 左右，长度不小于lOOmm。

清洗安部管时，先用2 %盐酸浸泡过夜，然后用自来水冲洗3 次以上，最后

用蒸馆水冲洗、浸泡至pH 中性， 然后干燥。

4.3 标签的准备

保藏菌种的标记方法有很多种，一般分为管外侧标记和管内标记两种。

管外侧标记常用以下两种方式:

一一采用标签机直接在安瓶管上打印菌种编号、保藏日期，大小为lcm X

3cm 左右。

一一将胶布剪成大约lcm 宽、3~4cm 长的小条，在上面填写菌种编号、保

藏日期，贴在安部管外。

管内标记法:选择滤纸或吸水纸(大小为lcmX 3cm 左右)记录菌种的编

号、保藏日期，然后装入安部管内。

4.4 保护剂的选择和准备

保护剂用来减少冷冻干燥引起的微生物细胞的损伤。保护剂的选择与配制因

所保藏的菌种的不同有所变化。配制保护剂时应注意保护剂材料的搭配、保护剂

的浓度及pH (一般保持中性)。常用的保护剂为脱脂乳。一般微生物保存常用

的保护剂参见附录B <<常用保护剂》。厌氧微生物冷冻干燥所用的保护剂在使用

前应在lOOOC 的沸水中煮沸1 5min 左右，脱气后放人冷水中急冷，以除掉保护剂中的溶解氧。

4. 5 菌种的准备

参见附录c ((菌种的准备》。

4.6 分装与加棉塞

分装菌液应在无菌条件下操作。采用较长的滴管，直接将菌液滴人安瓶管或

冻存管底部，注意不要溅污上部管壁，每管分装量约O. l ~O. 2ml 。若是球形安

瓶管，装量为半个球部。一般2~2. 5ml 菌液可以分装l O~15 个安部管。分装后

用脱脂棉堵住安部管管口，注意不要过紧或过松。分装时间尽量要短，最好在

1 ~2 h 内分装完毕并预冻。

4.7 预冻

一般预冻2h 以上，温度达到一40℃左右。目前常用降温方法有以下三种:

——程序控温降温法。应用程序控制降温仪，可以稳定连续降温，能很好地

控制降温速率。

——冷冻干燥机自行冷冻。某些冷冻干燥机具有冷冻功能，在真空泵不开启

的情况下，可将菌种冷冻到一40℃左右。

——将菌种放人-80℃冰箱预冻。预冻速度控制在每分钟下降l OC ，使样品

冻结到-35—-40℃。

4.8 冷冻干燥

采用冷冻干燥机进行冷冻干燥。

将预冻后的样品安瓶管迅速置于已充分预冷的冷冻干燥机样品舱内，关闭放

气阀，打开真空泵开始冷冻干燥，接近干燥完成时，适当升温(按冷冻干燥机的

具体要求进行操作) ，确认冷冻干燥完毕后， 缓慢打开放气阀，取出样品安瓶管置于干燥器内，备用。冷冻干燥时间一般为8—20h。

判断冷冻干燥已完全的指标:

——安瓶管内冻干物呈酥松块状或松散片状。

——真空度接近空载时的最高值。

——冷冻干燥机显示的样品温度与舱内温度接近。

——蒸馏水对照管中的水分已完全挥发掉或1%—2%氯化钻的对照管巳呈

深蓝色。

4.9 安起管封口及真空检验

从干燥器中取出冷冻干燥完全的安部管，在距管口5cm 左右用喷射火焰

(喷灯、焊枪等)将安商管拉细，然后将安瓶管口连接到与真空安部管泵相连的

橡皮管上，打开真空泵，在真空条件下(一般真空度达到0.001 托) ，用喷射火

焰对准安商管细颈部加热熔封。

熔封后的干燥管可采用高频电火花真空测定仪检测真空度。

4.10 保藏

封口完全的冷冻干燥管应低温避光保藏。

4. 11 质量检查

一般在封口后1 天、7 天、30 天随机抽取若干支冷冻干燥管进行各项指标检查，如存活率、生产能力、形态变异、杂菌污染等。可参见《微生物菌种纯度检测技术规程》。

4.12 冷冻干燥法适用范围

适用于大多数细菌、放线菌、病毒、噬菌体、立克次体、部分丝状真菌和酵

母菌等的保藏，但不适用于藻类和原虫等的保藏。

4.13 保藏周期

不同微生物的保藏周期不同，一般在10 年左右。

4.14 复苏方法

4. 14. 1 冷冻干燥菌种的复苏方法

先用70%酒精棉擦拭安部管的上部，将安瓶管顶部烧热，用元菌棉签沾灭

菌水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用铿刀或慑子颈部轻叩一下，敲下已开裂

的安部管的顶端。或直接用玻璃刀划开用灭菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸

管移人新鲜培养基，进行培养。

4.14.2 低温冷冻菌种的复苏方法

从一80.C 冰箱或液氮罐中取出安瓶管或冻存管，立即放置在38~40.C 温水

中快速复苏并适当摇动，直到内部结冰全部溶解为止， 一般需50~ 100s o 在无

菌条件下开启安瓶管或塑料冻存管，将管内保藏物接种至适宜的培养基上进行

培养。

以上方法适用于普通微生物菌种的冷冻干燥。对于庆氧微生物、病原微生物

等菌种的冷冻干燥流程与前面方法相似，但是在菌种的准备、复苏等环节稍有差

异。操作过程应注意生物安全防护，可参照《不同生物安全级别微生物菌种操作

规程》。

5 微生物菌种低温冷冻保藏技术规程

5.1 液氮超低温保藏技术

5. 1. 1 安商管或冻存管的准备

宜选用耐温度骤变，耐压，管壁厚度均一并且为中性玻璃的安瓶管，或螺旋

口的塑料冻存管。注意玻璃管不能有裂纹。清洗安部管时，先用2% 盐酸浸泡过

夜，然后用自来水冲洗3 次以上，最后用蒸馆水冲洗、浸泡至pH 中性，然后干

燥。塑料冻存管用蒸馆水浸泡、冲洗干净、干燥即可，然后在121.C 下高压灭菌

1 5~20min 或160℃烘箱中干热灭菌拙，备用。

5. 1. 2 标签的准备

安瓶管或塑料冻存管的标记一般采用专用非水溶性记号笔，记录菌种编号、

保藏日期。

5. 1. 3 保护剂的选择与准备

保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度，一般采

用10 %~20%甘油。参见附录B ((常用保护剂》。

5. 1. 4 菌种的准备

微生物的生理状态对液氮保藏的存活率有影响，一般采用对数生长期的中期

或后期的培养物。菌种制备有多种方法，参见附录C 《菌种的准备》。

 

5. 1. 5 菌液分装

菌液分装参见4. 6 《 菌液分装与加棉塞》。若用安瓶管分装菌液，在分装完毕后应在距管口5cm 左右用喷射火焰(喷灯、焊枪等)将其熔封，若用冻存管

分装的，应立即拧紧螺帽。

5. 1. 6 预冻

预冻时，冷冻速度一般控制在每分钟下降l OC ，冻结到一35~ - 400C 。参见4.7 《预冻方法》。

5. 1. 7 保藏

将安瓶管或塑料冻存管置于液氮罐中保藏。一般气相温度为-150℃ ，液相

温度为-196 0C 。

5. 1. 8 保藏周期

一般10 年以上。

5. 1. 9 复苏方法

参见4. 14 《复苏方法》。

5. 1. 10 适用范围

各类微生物。

5. 1. 11 液氮保藏应注意事项

一一防止操作人被冻伤，操作时应注意安全，戴面罩及皮手套。

一一若用塑料冻存管保藏， 一定要拧紧螺帽。

一一运送液氮时一定要用专用特制的容器，绝不可用一般密闭容器存放或运

输液氮，切勿使用保温瓶存放液氮。

一一存放液氮容器的室内要注意通风，防止过量氮气使人窒息。

一一防止安瓶管破裂爆炸。如液氮渗入安瓶管内，当从液氮容器中取出时，

液态氮体积将膨胀约680 倍，爆炸力很大，要特别小心。

一一注意观察液氮容器中液氮的残存量，定期填充液氮。

5.2  -80"C低温冷冻保藏

5. 2.1 安瓶管或冻存管的准备

宜选用耐温度骤变， 耐压，管壁厚度均一并且为中性玻璃的安部管， 或螺旋

口的塑料冻存管。注意玻璃管不能有裂纹。清洗安瓶管时，先用2 %盐酸浸泡过

夜，然后用自来水冲洗3 次以上，最后用蒸馆水冲洗、浸泡至pH 中性，然后干燥。塑料冻存管可用蒸馆水浸泡冲洗干净、干燥即可，然后在121℃下高压灭菌15 —20min 或160℃烘箱中干热灭菌2h，备用。

5.2.2 标签的准备

塑料冻存管的标记一般为管外标记，即用专用非水溶性记号笔标记菌种编

号、保藏日期。

5.2.3 保护剂的选择与准备

保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度， 一般采用10%~20%甘油。参见附录B《常用保护剂》。

5.2.4 菌种的准备

微生物不同的生理状态对存活率有影响，一般使用对数生长期的中期或后期

的培养物。菌种制备有多种方法。参见附录C《菌种的准备》。

5.2.5 菌液分装

参见4.6 《 菌液分装与加棉塞》。

5.2.6 保藏

将安瓶管或冻存管置于-80 0C 冰箱内保藏。

5.2.7 保藏周期

一般1~2 年。

5.2.8 复苏方法

参见4. 14 《复苏方法》。

5.2.9 适用范围

各类微生物。

 

 

——节选自微生物资源平台丛书《微生物菌种资源收集、整理、保藏技术规程》第一卷 -------中国农业出版社