真空冷冻干燥保藏

1.  冷冻干燥管的制备
1.   安瓿管材料以中性玻璃为宜。清洗安瓿管时，先用2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至pH中性，干燥后、装入标有保藏编号和保藏时间的标签（硫酸纸打印，大小1cm×3cm左右），纱布和纸包扎，121℃下加压灭菌20分钟，备用。
2. 保护剂的准备
   12%的脱脂乳（BD公司DifcoTM Skim Milk）1ml分装于2ml离心管中，121℃下加压灭菌15分钟，4℃冰箱冷藏备用。
3. 冻干样品的准备
   在最适宜的培养条件下将待保藏的微生物培养至静止期或成熟期，若是液体培养需离心除去培养基；若是固体培养，以接种环刮取菌体（或用棉签刮取）与保护剂混合均匀，分装。培养物浓度以细胞或孢子不少于108-1010个/ml为宜。用较长的毛细滴管，滴入安瓿管底部，注意不要溅污上部管壁，每管分装量约0.1毫升。分装安瓿管，时间尽量要短，分装后立即预冻。还应注意多次核对菌种与各分装管的编号与名称是否相符。
4. 预冻
   先放4℃冰箱，半小时后放-20℃冰箱。一般预冻2小时以上。
5. 冷冻干燥
将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内，开始冷冻干燥，时间一般为8-20小时。终止干燥时间应根据下列情况判断：
——  安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状；
——  真空度接近空载时的最高值；
——  样品温度与管外温度接近；
——  选用1-2支对照管，内装蒸馏水，其水份装量与菌悬液同量，当水分完全升华后，可视为干燥完结；
——  选用一个安瓿管，装1-2%氯化钴，如变深兰色，可视为干燥完结。
冷冻干燥完毕后，取出样品安瓿管置于干燥器内，备用。
6. 真空封口及真空检验
真空显示0.021mPa以下，在真空条件下将安瓿管腰部加热熔封。熔封后的干燥管可采用高频电火花真空测定仪测定真空度.
7. 保藏
安瓿管装入专用塑料袋，按保藏编号顺序排列，4℃冷柜避光保存。
8. 冷冻干燥法适用范围
大多数细菌、放线菌、病毒、噬菌体、立克次体、霉菌和酵母菌等的保藏，不适用于霉菌的菌丝型、菇类、藻类和原虫等。
9.  保藏周期
不同微生物的保藏周期不同，一般在10年左右。
10.  复苏方法
  —— 先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部，
—— 将安瓿管顶部烧热，
—— 用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端，
—— 用培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养。
11. 质量检查
冷冻干燥后抽取1－2支安瓿管进行各项指标检查，如存活率、生产能力、形态变异、杂菌污染等。