液氮超低温冻结保藏

1. 冻存管的准备
进口2.0 ml已灭菌内螺旋冻存管。型号：Corning 2028, Corning公司。
2. 保护剂的准备
分析纯甘油加纯水配制成20%浓度，灭菌。
3. 微生物保藏物的准备
微生物不同的生理状态对存活率有影响，一般使用静止期或成熟期培养物。菌种的准备可采用下列两种方法：
1）刮取培养物平板上的孢子或菌体，与保护剂混匀后加入冻存管内；
2） 接种液体培养基，振荡培养后将菌悬液离心，去上清，将菌体与保护剂混合分装于冻存管内。
每个冻存管的分装量为1ml。
冻存管的标记为管外标记，用专用的非水溶性记号笔标记菌种保藏编号与保藏日期。
注意：分装与标记时要多次核对该菌种与所分装管的标记是否正确无误。
4. 预冻
使用分段降温法：将分装后的菌种管先放4ºC冰箱，半小时后放-20℃冰箱中2小时，然后放80ºC冰箱2小时以上， 取出后放入液氮罐中快速冷冻。
对耐低温的微生物可以直接放入气相或液相氮中。
5. 保藏
    将塑料冻存管置于液氮罐中保藏。一般气相中温度为-150℃，液相中温度为-196℃。
6. 保藏周期
一般10年以上。
7. 复苏方法
从液氮罐中取出冻存管，立即放置在38℃-40℃水浴中快速复苏并适当摇动。直到内部结冰全部溶解为止，一般约需50秒-100秒。开启冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。
8. 适用范围
各类微生物。
9. 液氮保藏应注意事项
——  防止冻伤，操作注意安全，带面罩及防冻手套；
——  塑料冻存管一定要拧紧螺帽；
——  运送液氮时一定要用专用特制的容器，绝不可用密闭容器存放或运输液氮，切勿使用保温瓶存放液氮；
——  注意存放液氮容器的室内通风，防止过量氮气使人窒息；
——  防止塑料冻存管破裂爆炸，如液氮渗入管内，当从液氮容器取出时，液态氮体积膨胀约680倍，爆炸力很大，应特别小心；
——  注意观察液氮容器中液氮的残存量，定期补充液氮。
10. 质量检查
 保存一段时间后抽取1－2支冻存管进行各项指标检查，如存活率、生产能力、形态变异、杂菌污染等。